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 產(chǎn)品概述

本品是利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，cDNA產(chǎn)物可直接用于qPCR檢測(cè)。qRT SuperMix中包含反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有組分，并針對(duì)Oligo dT(18T) Primer、 Random 6 mers Primer用量進(jìn)行了優(yōu)化，使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兼容染料嵌合法和探針法qPCR檢測(cè)，能夠進(jìn)行高效的基因表達(dá)分析。在進(jìn)行下游定量PCR實(shí)驗(yàn)中，Total RNA中混入的基因組 DNA（gDNA）可直接作為反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，可能會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性。本品中g(shù)DNA Eraser Mix可有效去除殘留的基因組DNA，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本品中配有NRT Control Mix，可用于配制無反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照反應(yīng)。

 產(chǎn)品組成

*1：gDNA Eraser Mix可搭配 5X qRT SuperMix或NRT Control Mix 使用。

*2：該溶液含有Evo M-MLV RTase、RNase Inhibitor、dNTPs、Oligo dT (18T) Primer與Random 6 mers Primer

*3：該溶液不含Evo M-MLV RTase， 其余組分與 5X qRT SuperMix完全相同

 儲(chǔ)存及運(yùn)輸條件

冰袋運(yùn)輸。試劑置于-20 ℃保存，有效期18個(gè)月。

 操作方法

1. 去基因組DNA與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

本產(chǎn)品有兩種使用方法，可根據(jù)需求進(jìn)行選擇。操作如下：

l 方法一： All in one（去除gDNA與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行）

當(dāng)RNA質(zhì)量較高（gDNA殘留少），或反應(yīng)中RNA濃度較高、目標(biāo)基因拷貝數(shù)較高時(shí)，可將去除gDNA與反轉(zhuǎn)錄合為一步操作。

按照下表配制反應(yīng)液^{*1、 *2}，同時(shí)進(jìn)行基因組DNA去除與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反應(yīng)條件

*1：反應(yīng)體系可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，各組分按比例變更即可

*2：配制試劑時(shí)，建議加樣順序按照RNase free water、gDNA Eraser Mix、 5X qRT SuperMix依次添加，配制完成后用移液器輕柔吸打混勻，混勻后加入 RNA 模板。NRT Control 是指無反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照反應(yīng)，可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行配制。配制時(shí)，將5X qRT SuperMix替換成 NRT Control Mix 即可

*3：Total RNA 可根據(jù)需要添加，提取的 RNA 建議使用 RNase free water 進(jìn)行溶解。在20μl 反轉(zhuǎn)錄體系中，使用 SYBR 法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)，建議Total RNA加入量不超過 1μg；使用探針法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)，建議Total RNA加入量不超過 2μg。

*4：反應(yīng)產(chǎn)物如立即用于后續(xù) qPCR 反應(yīng)，可暫放于 4℃或冰上；如短期保存建議放置于-20℃；如長(zhǎng)期保存建議放置于-80 ℃。

l 方法二：兩步法（先去除gDNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄）

1.1 去除gDNA

按照下表配制反應(yīng)液^*1、*2，進(jìn)行基因組DNA去除反應(yīng)。

反應(yīng)條件

*1：反應(yīng)體系可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，各組分按比例變更即可

*2：配制試劑時(shí)，建議先將gDNA Eraser Mix與RNase free water配制成預(yù)混液，用移液器輕柔吸打混勻后，再加入RNA模板。

*3：Total RNA可根據(jù)需要添加，提取的RNA建議使用RNase free water進(jìn)行溶解。在20μl 反

轉(zhuǎn)錄體系中，使用SYBR法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)，建議Total RNA加入量不超過1μg；使用探針法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增時(shí)，建議Total RNA加入量不超過2μg。

*4：反應(yīng)產(chǎn)物取出后置于冰上，立即進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1.1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液^*1，置于 PCR 儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反應(yīng)條件

*1：反應(yīng)體系可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，各組分按比例變更即可。

*2：NRT Control 是指無反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照反應(yīng)，可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行配制。 配制時(shí)，將5X qRT SuperMix替換成 NRT Control Mix 即可

*3：若反應(yīng)產(chǎn)物立即用于后續(xù) qPCR反應(yīng)，可暫放于4℃或冰上；如短期保存建議放置于-20℃，如需長(zhǎng)期保存建議放置于-80℃。

2. 定量 PCR 分析

經(jīng)上述反轉(zhuǎn)錄過程得到的 cDNA 可以直接進(jìn)行定量 PCR 分析。推薦搭配本公司產(chǎn)品 SYBR Green qPCR premix試劑盒使用。